自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解析開始，人們在探究健康與疾病基因組復雜性與差異性上付出巨大努力，測序通量限制和高昂成本成為人們深入分析基因組的首要障礙，2005年推出高通量測序技術(shù)初步解決了這個問題，人類基因組測序成本迅速下降，由此產(chǎn)生一個新名詞：下一代測序(next-generation sequencing， NGS)。在過去十多年，NGS不斷進化，人類基因組測序成本已經(jīng)下降至1 000美元/人。
一、NGS技術(shù)平臺、發(fā)展趨勢及臨床應用現(xiàn)狀
國內(nèi)臨床應用短讀長NGS技術(shù)主要基于邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis， SBS)的Life平臺和Illumina平臺。Life Ion-Torrent平臺采用單核糖核酸增加(single-nucleotide addition， SNA)方法，Illumina平臺依賴于循環(huán)可逆終止(cyclic reversible termination， CRT)技術(shù)。盡管短讀長NGS平臺總體準確率較高(>98%)，但讀取高AT或高GC片段錯誤率仍差強人意。由于基因組包含重復序列、結(jié)構(gòu)變異及拷貝數(shù)變化，短讀長測序平臺解析這些信息存在固有缺陷，近幾年相繼推出基于單分子測序和合成法測序第三代測序。PacBio Biosciences單分子實時測序，其PacBio RS Ⅱ平均測序讀長10 000～15 000 bp。2014年，另一種基于納米單分子測序技術(shù)原型機-MinION誕生，平均測序讀長>10 000 bp。合成法長讀長測序平臺發(fā)展有2個系統(tǒng)：Illumina長片段合成系統(tǒng)與10×Genomics乳液系統(tǒng)。第三代長讀長測序平臺單個堿基錯誤率較高。
NGS技術(shù)廣泛應用于常規(guī)臨床實踐，應用領(lǐng)域包括無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(noninvasive prenatal test，NIPT)和胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening，PGD/PGS)、遺傳病、腫瘤、藥物基因組等。2014年6月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準首個NGS診斷產(chǎn)品用于胎兒染色體非整倍體檢測。NIPT是國內(nèi)NGS應用最為成熟的領(lǐng)域。NGS應用于PGD/PGS優(yōu)點在于能夠利用單一平臺實現(xiàn)單基因病和染色體異常分析。2014年9月我國誕生世界首例應用多重退火成環(huán)循環(huán)擴增技術(shù)進行胚胎全基因組擴增NGS測序試管嬰兒。隨著檢測費用降低和基因解讀能力提高，NGS應用遺傳病特別是罕見病，已經(jīng)由基因組合向全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)和全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)轉(zhuǎn)變。2010年，應用WES技術(shù)僅通過4個病例WES即發(fā)現(xiàn)米勒綜合征致病基因DHODH。2016年一項前瞻性研究評估證實單病例WES作為一線分子檢測技術(shù)用于新生兒單基因疾病診療臨床效用性。2016年另一項涉及54個國家1 000個家庭研究表明，WGS對未確診疾病診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法還高。
目前腫瘤NGS檢測主要應用于遺傳性腫瘤綜合征篩查和體細胞突變分析。NGS使腫瘤防治措施前移至預防階段。大量研究證實某些遺傳性腫瘤與關(guān)鍵基因突變相關(guān)，2017版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南指出可利用NGS檢測相關(guān)基因突變并行遺傳咨詢。如與遺傳性乳腺癌和卵巢癌、林奇綜合征和神經(jīng)纖維瘤等相關(guān)高外顯率基因突變等，此外還有一些中等外顯率和低外顯率基因。NGS在體細胞突變分析領(lǐng)域應用最為廣泛，通過NGS分析腫瘤起始、發(fā)展和轉(zhuǎn)移階段遺傳變異及相關(guān)驅(qū)動突變和伴隨突變，有助于腫瘤患者分類、預后、靶向治療、耐藥性分析。國際上相繼成立多個測序計劃致力于破譯癌癥細胞突變模式。癌癥基因組計劃已經(jīng)發(fā)掘近500萬個腫瘤體細胞基因突變，并建立了全世界最大、最廣泛的癌癥體細胞突變數(shù)據(jù)庫。這些大量前期工作為后續(xù)NGS臨床應用打下堅實基礎(chǔ)。如今臨床利用腫瘤熱點突變基因組合，可在1 d內(nèi)對幾百個腫瘤相關(guān)基因幾千個熱點突變位點進行快速檢測。
腫瘤液體活檢和單細胞測序是NGS應用新方向。腫瘤患者外周血含有循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)或者游離腫瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)。CTC和ctDNA取材便利，適用于腫瘤個體化診斷、預后、復發(fā)風險評估。2014年一項非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血漿ctDNA NGS檢測發(fā)現(xiàn)，對Ⅱ～Ⅳ期NSCLC檢測敏感性100%。由于常規(guī)測序樣品來源均是多細胞混合DNA，得到的序列信息是一群細胞基因信息平均值，或其中占優(yōu)勢數(shù)量細胞DNA信息，而單個細胞特性被忽視。單細胞NGS測序能夠揭示細胞個體間差異，可為腫瘤分子分型和個體化治療提供精細化指導，有助于準確理解腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性和腫瘤演進。
越來越多證據(jù)表明，在相關(guān)藥物代謝通路，編碼藥物代謝酶或相關(guān)蛋白基因遺傳變異決定個體藥物反應或藥物敏感性。不同患者對同一藥物毒性和療效有不同反應。臨床藥物基因組學發(fā)展日新月異。截至目前，美國食品藥品管理局公布了140余種藥物，建議通過遺傳信息指導其合理使用，美國臨床遺傳藥理學應用委員會發(fā)布了35個藥物臨床藥物基因組學應用指南。目前個體化用藥主要針對某種藥品開展一個或少數(shù)幾個基因分型篩查。例如某些針對表皮生長因子受體靶向藥基因突變檢測、鉑類藥物相關(guān)敏感性基因檢測和細胞色素P450家族基因如CYP2D6分型檢測等。影響藥物代謝或敏感性基因很多，應用NGS技術(shù)可以得到單個患者成百上千個基因分型結(jié)果，全面指導其用藥。
二、NGS技術(shù)臨床應用質(zhì)控問題的現(xiàn)狀和解決辦法初探
NGS檢測比常規(guī)分子檢測復雜，實驗操作部分和生物信息分析部分包括眾多實驗處理和分析程序。從樣本制備到數(shù)據(jù)分析，NGS過程每一步都可能混入錯誤。因此凸顯臨床檢測質(zhì)控重要性。2015年，國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心NGS檢測體細胞突變有效性室間質(zhì)評結(jié)果分析表明，64家參評實驗室僅33家檢測性能達到標準，只有17家實驗室能正確識別基因組合所有突變，充分反映NGS檢測過程復雜性和制定統(tǒng)一檢測規(guī)范迫切性[12]。目前NGS缺乏統(tǒng)一行業(yè)規(guī)范和檢測標準，導致不同實驗室不同平臺檢測結(jié)果無法比較。需要對NGS實驗操作部分和生信分析部分建立執(zhí)行標準和質(zhì)控監(jiān)測事項。包括建立標準操作流程、驗證流程、質(zhì)量管理體系、數(shù)據(jù)可靠性驗證等。生物信息分析部分應包括：變異結(jié)果描述、附帶結(jié)果報道、數(shù)據(jù)儲存和版本可追溯性等。此外，標準品應用應貫穿在NGS檢測整個流程。
三、NGS技術(shù)臨床應用數(shù)據(jù)分析要點和報告內(nèi)容及格式要求
NGS實驗室對變異結(jié)果描述及報告需遵循專業(yè)組織建議與指導。建議遵循人類基因組變異協(xié)會命名指南和美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會遺傳疾病變異分類指導。為避免結(jié)果混淆，在撰寫臨床結(jié)果報告時，需要詳細列出每個變異位點對應的轉(zhuǎn)錄本版本號及蛋白編號[12，14]。在描述疑似致病性變異時，需充分考慮疾病表型、不同人群發(fā)病率、外顯率及功能學實驗，并需要充分利用一些公共數(shù)據(jù)庫。對于一些外顯子組或基因組檢測來說，評估一個基因?qū)膊∮绊懗潭龋私獠煌儺愵愋蛯膊∝暙I度及這些變異遺傳模式至關(guān)重要[12，15]。報告內(nèi)容和格式要求可參考中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會發(fā)布的《臨床基因檢驗診斷報告模式專家共識》、美國分子病理學會、美國臨床腫瘤學會和美國病理學會專家共識。以及歐盟NGS診斷指南[17]。NGS檢測報告清晰性和一致性至關(guān)重要，應準確客觀地描述所檢驗結(jié)果，避免引起歧義。內(nèi)容總體應該明確簡潔并具有充分解釋。
四、我國NGS技術(shù)發(fā)展需要注意的幾個問題
當前國內(nèi)NGS技術(shù)硬件和國外發(fā)展同步，但軟件建設(shè)滯后，硬件建設(shè)可以通過購買迅速完成，軟件建設(shè)需要長時間積累。軟件建設(shè)包括適合國內(nèi)國情的規(guī)范的檢測指南，合理有效的監(jiān)管措施，完善數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)以及符合患者需求的遺傳咨詢體系等。此外，為保證臨床和檢測實驗室溝通順暢，需要積極提倡中文人類表型標準用語。隨著基因測序技術(shù)飛速發(fā)展，獲取基因數(shù)據(jù)越來越便捷，與之對應表型信息采集效率滯后。由于臨床醫(yī)學歷史悠久，疾病命名和分類復雜多樣;很多疾病存在臨床變異性，不同醫(yī)師對于患者描述也存在差異。模糊表型信息與基因數(shù)據(jù)連接存在障礙，給基因數(shù)據(jù)解讀帶來困難。
五、展望
隨著NGS技術(shù)不斷改進，高通量長讀長NGS將是大勢所趨，檢測對象將逐漸從DNA層面向RNA層面轉(zhuǎn)移。新一代NGS檢測靈敏度、準確性和操作便捷性將大大提高。我們有理由相信隨著檢測費用持續(xù)下降、測序方法優(yōu)化升級、數(shù)據(jù)解讀能力智能化以及臨床經(jīng)驗不斷積累，人員培訓、數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制、倫理等問題都將迎刃而解，NGS技術(shù)將會逐漸成為臨床主要且常規(guī)的檢測項目。