金標免疫層析技術是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析技術等多種技術結合在一起的固相標記免疫技術，因其操作簡便、快速，且具有很高的異性和敏感性，已廣泛應用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）、鼠疫、乙肝、寄生蟲、艾滋病等臨床檢測中[1]。金標免疫試紙條檢測目前主要停留在定性判斷，應用范圍受到很大限制。定性判斷容易受人為因素的干擾，且靈敏度低，可能出現“假陽性”與“假陰性”，而且在臨床上不能建立該待檢指標的動態過程[2-3]。因此，研究試紙條的定量測試儀器具有重要意義。

    國內外學者對膠體金試紙條的定量測試進行了一系列研究，光電檢測技術是普遍采用的檢測方案，但是信號的接收部分存在多種設計方案，各有優弊。采用光敏電阻測量方案，電路簡單、測量光強范圍廣，但是光敏電阻在測量中存在嚴重的阻值漂移，影響測量精度；采用CCD、CMOS等圖像傳感器測量顯色區域，雖然避免了設計機械掃描機構，但是后期對圖像的分析處理同樣復雜，而且這種方案成本較高，難以在市場上推廣。本文設計的儀器采用綠光LED作為發射光源，以光電二極管接收試紙條反射光，并通過步進電機帶動檢測系統掃描試紙條待檢區域，從而快速、準確讀取膠體金試紙條檢測結果。但由于檢測系統不可能處于完全黑暗的環境，必然會受到環境的噪聲干擾。對此，本儀器還通過控制光源信號的調制及接收信號的解調過程，使光電傳感器只對特定頻率光信號敏感，從而消除了光譜的背景光及環境電磁干擾，提高了儀器系統檢測精度。
1 金標免疫試紙條定量檢測原理
    金標免疫層析技術原理是：將特異性抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當干燥的硝酸纖維素膜一端滴入樣品（可取血、尿、唾液）后，由于滲透作用，樣品沿著纖維膜移動，當移動到固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，發生顯色。纖維素膜上一般有兩條線：檢測線（簡稱T線）和對照線（簡稱C線）。結果判定：如果檢測線和對照線均顯色，則為陽性，表明樣品中含有待檢物；如果僅對照線上顯色而檢測線未顯色，則為陰性結果，即未檢測到目標物質；如果對照線上未顯色，則無論檢測線上是否顯色，都認為此次檢測失敗。如果樣品中含有待檢物，則檢測線會顯色，而且樣品中目標待測物的含量越高，顯色會越深[1，4]。
    根據吸光度原理，物體顏色的深淺和光的吸收與反射有關。顏色越深，則對光的吸收越強，反射的光強就越弱。因此，目標待測物的濃度和檢測帶的反射光強呈負相關關系。在待檢物一定濃度內，可認為反射光強與其濃度成線性關系。基于以上原理，通過適當的光電檢測方法測量出反射光強，就可計算出目標待測物的濃度[3-5]。
2 系統設計
    金標免疫試紙條分析儀主要由機械掃描模塊、光路模塊、電路控制模塊、輸入輸出模塊組成，如圖1所示。電路控制模塊控制LED光源發出中頻光信號照射到試紙條上，然后驅動步進電機移動，以帶動機械掃描模塊移動。光電二極管接收掃描得到的試紙條上反射的光信號并將其轉換成電信號后送入電路控制模塊進行處理。該系統外擴微型打印機、LCD、SD卡等輸出設備，處理后得到的檢測結果可被即時打印出來或者由LCD顯示，也可存儲到SD卡，供后期海量數據的分析、比對使用。

2.1 系統光路設計及機械結構
    金標免疫試紙條上顯色物質為納米金顆粒，其聚集形成暗紅色條帶，對綠光的吸收最強烈。為了增加光強，本系統中對稱安裝一對高穩定性的強光綠色LED作為照明光源，其波長約為520 nm，接收部分使用高靈敏度的光電二極管。光路模塊結構如圖2所示，掃描系統機械圖如圖3所示。

    從圖2和圖3可以看出，LED光源和光電二極管組成光路系統。光路系統固定在封閉暗箱內，并可以隨步進電機沿著導軌滑動，實現對試紙條檢測區域的掃描。掃描一次的步程為11.5 mm，時間為8 s。
2.2 系統電路設計
    電路設計是本系統設計的重點。對試紙條的掃描檢測不可能在完全封閉、不透光的環境中進行，因此，光電傳感器接收的反射光信號中必然混雜著環境光線等一系列噪聲信號的干擾。如何從強干擾噪聲中提取出有效反射光信號是本次設計中的關鍵技術。
    干擾噪聲和有效反射光信號在測量中一直混雜著，很難從時域上區分，故考慮從頻域上去噪。干擾噪聲處于低頻段，而系統需要采集的反射光信號是與光源一致(即可調)的。所以可將綠光LED光源調制到中頻段，即可產生中頻段的反射光信號，再通過濾波、解調即可得到去除噪聲的有效光電信號[6]。
    如圖4所示，使用交流調制驅動LED，使LED發出的綠光處于2 kHz的中頻波段。試紙條反射的光信號通過光電二極管接收后轉為電流信號，電流信號通過精密I/V轉換電路后變成電壓信號。此電壓信號經過帶通濾波后，實現與干擾噪聲的分離，然后進行放大，得到交流待檢信號Signal_AC。Signal_AC 的幅值表征反射光的光強，但此信號無法直接送入A/D轉換器得到幅值，還需要恰當的檢波電路實現信號解調，經過檢波電路后的信號如圖4中Signal_AD。系統采用的A/D轉換器具有數字低通濾波器的功能，相當于將信號積分平均處理。如此，Signal_AD最終轉化成直流信號，再進行采樣送入單片機處理。

3 實驗結果及分析
    實驗樣品如圖5所示，每張試紙條中有兩條紅線，其中上面一條顏色較深，為C線，起對照作用；下面一條顏色較淺的為T線，T線顏色深淺即表征樣品的濃度大小。配置T/C深淺比值分別為100%、50%、30%、10%、5%的5個試紙條進行掃描測試。

    掃描檢測的結果如圖6所示。每條試紙條掃描后的波形有兩個波谷，表征兩條色帶對光源的兩個吸收峰。為了準確獲取曲線上的T值、C值，采用面積積分法，即分別求取兩個波谷面積T_Area、C_Area，然后求取波谷相對面積比T/C。從圖中可以看出，5份樣品中對照線、檢測線均被檢出，檢測結果分別為100%、49.2%、29.6%、10.6%、4.5%。每份樣品檢出值與實際值誤差均小于1%。對2號、5號樣品分別掃描檢測10次，結果如圖7所示。2號樣品均值為4.49%，變異系數為1.15%；5號樣品均值為49.5%，變異系數為0.5%。可見，該系統檢測結果穩定性很高，變異系數小于2%。

    基于光電檢測技術成功研制了一套金標免疫試條分析儀。系統通過對光源信號的調制及對接收信號的解調技術，成功去除了干擾噪聲，提高了儀器檢測精度。使用標準金標試紙條進行實驗，檢測結果與實際值非常接近，誤差小于1%；樣品的重復性實驗變異系數均低于2%，表明該儀器測量結果穩定性高，抗干擾能力強。本儀器在金標試紙條的快速、定量檢測中有廣闊的應用前景。
參考文獻
[1] KIM S，PARK J K.Development of a test strip reader for a lateral flow membrane-based immunochromatographic assay[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2004(9)：127-131.
[2] Qiu Xianbo，Liu Changchun，MICHAEL G.A portable analyzer for pouch-actuated,immunoassay cassettes[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2011，160(1)：1529-1535.
[3] 黃立華，曾愛軍，張友寶，等.金標免疫試紙條反射式光度計的研制[J].儀器儀表學報，2009，30(3)：663-667.
[4] 杜民.基于光電檢測與信息處理技術的納米金免疫層析試條定量測試的研究[D].福州：福州大學，2005.
[5] 張友全，楊成文，陳峰，等.一種新型便攜式甲霜靈膠體金試紙條顯色分析儀的研制[J].儀器儀表學報，2009，30(10)：2175-2179.
[6] 潘軼，葉樹明，楊俊毅，等.基于偽隨機序列調制的熒光測量系統[J].儀器儀表學報，2011，32(7)：1470-1477.