The Challenge:
開發一個比傳統系統更加易于使用的，易于攜帶的，并且成本更低廉的小型熱循環儀。
The Solution:
使用NI公司的CompactDAQ硬件系統和LabVIEW軟件來創建小型熱循環儀，并且憑借USB接口的即插即用功能，以執行實時的聚合酶鏈反應。
Author(s):
Hsieh Tseng Ming James - Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A-Star
聚合酶鏈反應（PCR）熱循環是進行分子診斷的黃金準則。然而，在應對流感大流行方面，全球所面臨的主要挑戰是只有專業人員才能進行有效的診斷測試。此外，商業上可用的熱循環儀也只能用于實驗室環境使用，因此，我們很難對其進行操作，要將商用熱循環儀的應用領域擴大到緊急情況下，以及公共檢測站，例如機場，其笨重且昂貴的特性無疑是一個障礙。因此，迫切需要我們開發一種便宜的，可攜帶的，且可任意使用的分子診斷工具。
為了提供靈活的，成本低廉的診斷系統，我們在新加坡生物工程和納米技術研究所的研究小組開發了一個小型診斷系統，該診斷系統采用美國疾病控制和預防中心（CDC）所推薦的PCR技術來檢測傳染性急病。我們的系統從實時PCR到病毒基因目標鏈的檢測對整個診斷過程進行整合與自動化，以執行數據的分析。
通過使用NI 公司的CompactDAQ硬件系統，以及用于控制和數據分析的LabVIEW圖形化系統設計軟件作為我們的解決方案，我們創建了一個小型且便攜式的系統。該系統由一個較小的珀爾帖器（溫度裝置），電源供應器（能量裝置），和具有USB接口即插即用功能的光檢測器（光學裝置）構成。
我們的熱循環儀是便攜式的，完全自動化的，且可用于在重要場合中大規模健康檢查的情況下使用，例如在機場檢查站控制傳染性疾病的傳播。系統自動化是可靠診斷的一個關鍵優勢，因為流感大流行可能會在偏遠地區發生，那里可能沒有受過專業訓練的人員處理試驗樣品。此外，系統自動化的實現大大降低了人力和培訓費用。
利用該系統同時運行包含預加載PCR反應物的三個聚合物，從抽樣到結果所花費時間不到一小時，并且允許采用大量生物的多樣性。利用熱敏電阻的實時溫度反饋，一個內部比例積分微分(PID)芯片來處理溫度控制。該控制器由一個補償器，輸出裝置和傳感器反饋信號組成，反饋信號對于控制加熱器輸出功率，以及保持溫度是很必要的。使用LabVIEW軟件，我們對圖形用戶接口進行編程，以顯示實時溫度，設置溫度，并且顯示來自三個通道的實時PCR結果 (如圖1A所示)。
系統配置
整個集成系統的配置包括執行PCR系統運行和反應的循環溫控系統、固定安裝的三個藍色LED光源、排布于LED至光電倍增管(PMT)光路之間用于實時光學探測的相關透鏡和濾波器。系統中包括一組銅制或黃銅制的加熱室，與放置樣本的聚合體反應室集成在一起。
LabVIEW是系統構架的核心，中心處理器單元的設計專門針對執行由LabVIEW預編寫的指令，可用于控制系統啟動和健康檢查、PCR運行的熱量循環控制、和多路復用熒光信號的光學檢測。
在PCR處理的循環溫控過程中，系統于退火循環的最后一秒進行光學檢測。三個LED同時由來自NI 9265模擬輸出模塊的電流驅動依次點亮，每個LED持續發光200 ms，在下一個LED燈點亮前熄滅當前LED燈。
特殊設計的裝置用于聚焦和引導LED光路傳輸。光在照射到放置DNA樣本的反應室之前要先通過一個濾波器。光線在到達PMT之前還需通過一系列透鏡和濾波器，最后由NI 9206模擬輸入模塊讀出該信號。
我們使用LabVIEW來進行信號處理以獲取數據集的均值，來自PMT的信號被放大并處理。之后將向用戶顯示數據，并通過主用戶菜單將該數據連續更新于三個獨立的曲線圖中(見圖2)。
PCR混合物被置于聚碳酸酯PCR反應室中，并加油以防止蒸發。PCR在以下溫度條件下完成：95 °C下持續20秒(Taq聚合酶活化) 、50 次循環的放大(在95 °C下保持5秒進行加熱變性、在60 °C保持60秒進行退火和延伸)。LabVIEW程序記錄每次循環中DNA復制發出的熒光。
穩定性和重用性
在分子診斷中，PCR是一種將特定DNA片段放大至分子級別的常用方法。在實現過程中，需要在94 °C下進行40至50次循環的熱變，在60 °C下進行退火，在60 °C下進行延伸。整個過程的關鍵點在于精確的溫度控制，保持2 °C/s的溫度上升率，以避免產生或放大錯誤的DNA序列。
我們使用LabVIEW來控制獨立的高端和低端參考輸出通道，并采用一塊由高速金屬氧化物半導體場效應晶體管(MOSFET)組成的電路，設計并制造了片上加熱方案，實現了PWM實時控制。溫度測量顯示，我們獲得的加溫和冷卻率分別為2.5 °C/s和2.2 °C/s。對于每一路的溫度設置，過沖小于1 °C，并且穩定性保持在±0.1 °C。
結果與結論
我們使用1至104的TaqMan探針，通過連續稀釋的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)互補DNA(cDNA) 來確認PCR的實時探測性能。結果證實，從Ct曲線中確定的敏感度與市場上的實時熱循環儀(圖1B)性能相當。
與市面上其它的熱循環儀相比，我們的系統更緊湊、便攜性更高，且恒溫性更好(表1)。系統的便攜性使其在大范圍流感爆發的早期發揮更大的作用。同時，該診斷系統非常適合在門診、急診室、公共檢查站點等地使用。此外，由于其便攜性好、價格低、體積小、且使用方便等特點，該熱循環儀在食品安全方面具有潛在的優勢。
參考文獻
1. J. Felbel, I. Bieber, J. M. Kohler, Chemical Surface Management for Micro PCR in Silicon Chip Thermocyclers, Proc. SPIE, 4937, 34-40, 2002.
2. S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Kohler, G. Mayer, A. Siebert, D. Schimkat, Temperature Controlled Chip Reactor for Rapid PCR, 2002.